この方法はInoue et al (1990) の方法を改変したもので，作成日数が短く（遅くとも２日目の夕方には完成する）培養を止めるタイミングも予測しやすいので，私のような慌て者に適した方法である．
手順
アウトライン：大腸菌を室温でＯＤ600が０.４になるまで培養，培地をＴＢに置換
１．１日目の午前．以下の器具をオートクレーブ滅菌，乾燥しておく．乾燥を急ぐときにはクリーンベンチの中でふたを開けて風を当てる．
ガラス試験管とディスポポリ栓１〜２本（ディスポの滅菌ファルコンチューブなどでもよい）
５０〜１００ｍｌ用の三角コルベン２本（アルミホイルでカバーを掛ける）（１本は予備）
２ｍｌマイクロチューブ１０〜１２本（コンピテントセルを液体窒素に保存する場合には液体窒素使用可のものに限る）
イエローチップ
ブルーチップ
（ストックがなければＳＯＢ，ＳＯＣ，ＴＢも作っておく）
２．１日目の夕方．ＳＯＢをガラス試験管に約２ｍｌ，三角コルベンに５０ｍｌ分注．厳密に無菌的に．適当な大腸菌株のグリセロールストックからイエローチップで１〜２μLとり，ガラス試験管中のＳＯＢに植菌．三角コルベンに入れたＳＯＢは冷蔵しておく．
３．３７℃で一晩振とう培養．翌朝にはたっぷり増えている．
４．２日目の午前．一晩培養した菌液約０.５〜２ｍｌを三角コルベン中のＳＯＢ５０ｍｌに加える．この時点で培地はわずかに濁る．室温で振とう培養．菌液の残りはグリセロールストックなどとしてとっておくことができる．
５．２日目の午後．ＯＤ600が ０.４程度になったら培養を止める．スタート時点での濃さにもよるが，２〜８時間程度が目安．「もう少し」になったら油断せずに１０〜２０分おきにチェックする．ただし，いきすぎても焦る必要はない．いきすぎたら２本目の予備の三角コルベンに植え継いで同じことを繰り返せばよい．初めてコンピテントセルを作るときにはきちんとＯＤを計ったほうがよい．この方法で作るコンピテントセルは培養液のＯＤのストライクゾーンが広いので，最適ＯＤ値の濁り具合を覚えておき，２回目からは感覚的でよい．濃いめのコンソメスープぐらい．通常の３７℃ｏ／ｎカルチャーよりもかなり薄い．
６．培養液を５分〜１時間程度氷冷したあと，滅菌ファルコンチューブ（５０ｍｌ）移しかえる．この段階から，できあがったコンピテントセルの分注，凍結までのあいだ，菌体を厳密に氷冷状態に維持する（暖めると効率の悪いものができる）．また，操作はクリーンベンチ内で行う．１０００〜３０００×Ｇ，４℃で１０〜５分程度遠心．ＯＤをちゃんと計らなくても，沈殿の大きさでだいたいの濃度を知ることもできる．アングルロータの場合は，沈殿はファルコンチューブの角に径１ｃｍぐらいの薄い広がりになる．株によっては（ＤＨ５αＦ'ＩＱなど）チューブ側面に薄いすじのように沈殿することもある．
７．遠心の待ち時間に，エッペンチューブ立てにオートクレーブした２ｍｌマイクロチューブを立てて，冷凍庫で冷やしておく．あまり早く冷やし始めると冷えすぎるので注意．
８．沈殿を上にしてデカントで上澄みを捨てる．チューブのリムにしずくができるが，ブルーチップを挿したピペットマンなどで吸い取るとよい．氷冷したＴＢを１５ｍｌ静かに加える．泡を立てないように静かに沈殿をＴＢに分散させる．ブルーチップを挿したピペットマンでＴＢを沈殿に吹き付けるようにするとよい．
９．遠心，上澄みの廃液を繰り返し，５ｍｌの氷冷したＴＢを加え，沈殿を分散させる．
10．ＤＭＳＯを３５０μL加え，直ちに緩やかに振って混ぜる．ＤＭＳＯは水分と出会うと発熱するので，ＤＭＳＯを加えたら菌液をしっかり氷冷する．コンピテントセルはこの時点で完成．
11．冷凍庫で冷やしておいたマイクロチューブを取り出し，できあがったコンピテントセルを５００μLづつ，暖まらないうちに手早く静かに分注する．
12．液体窒素または−８０℃で凍結保存．液体窒素保存の場合，１年ぐらいはほとんど効率低下しない．
トランスフォーメーションの手順
アウトライン：コンピテントセルとプラスミドを混ぜて氷上で３０分静置，ヒートショック，１時間オーバーグロース
１．培養時間を考慮して，午後３時頃から始める．凍結保存したコンピテントセルを氷上に置いてゆっくり解凍．手のひらなどで暖めてもよいが，振ったり暖めすぎたりしないように．解凍したコンピテントセルは氷上に置く．
２．解凍中に，２ｍｌのエッペンドルフセーフロックチューブの底にプラスミドやライゲーションミックスをイエローチップで水玉のようにくっつけておく．操作は無菌的に．次の操作までチューブを氷上で十分に冷やしておく．
３．プラスミドまたはライゲーションミックスの入ったエッペンチューブに，解凍したコンピテントセルを１００μL静かに注ぐ．激しく撹拌しない．
４．氷上に２５分静置．
５．湯沸かしのお湯をボウルに入れるか鍋に水を入れて軽く沸かし，温度計で測りながら４３〜４４℃にする．この操作にだいたい５分ぐらいかかる（２５＋５＝３０分）．
６．チューブをフロートに挿してお湯に浮かべ，４５〜５０秒間ヒートショックする．
７．チューブを氷冷する．マニュアルでは１〜２分とあるが，すぐに次の操作をしてもそれぐらいの時間になる．むしろ，もたもたして５分以上氷冷すると効率が落ちるらしい．
８．ＳＯＣを１ｍｌ加えて３７℃で４０分から６０分シェイク．あらかじめＳＯＣを３７℃にしておくとマニュアルにはあるが，冷蔵庫から出してすぐ使用しても効率は変わらないようである．
９．シェイクしている間に，ＬＢ，Ａｍｐ（ベクターとホストの組合せによる）アガープレート１〜２枚にＸｇａｌとＩＰＴＧを適量（約２０＆１０μL＋ミリＱ２０〜５０μL，量をケチると水を加えないとうまくひろがらない）スプレッダーで塗りひろげる．クリーンベンチ内でプレートのふたをずらして乾かしておく．
10．ＳＯＣを入れてシェイクしたトランスフォーマントを１００μLスプレッダーで塗り広げる．ライゲーションミックスのデキがよくないと予想されるときには，残りを１５０００×Ｇでフラッシュして落とし，９割がた上澄みを捨て，残りに菌を分散させて２枚目のプレートに塗り広げる．そうでない場合でも，念のためにトランスフォーマントの残りを冷蔵庫に入れておくとよい．万が一翌朝コロニーの数が少ないとき，同様に濃縮して塗りなおすことができる．
11．プレートにパラフィルムを巻いて逆さにして３７℃でｏ／ｎインキュベートする．翌朝，コロニーを確認したら冷蔵庫で保管する．
トランスフォーメーションには思ったよりも時間がかかるので，私のような慌て者は手順４と８を短縮することがある．ちなみに，最初の氷冷とオーバーグロース（この場合にはＳＯＣをあらかじめ３７℃に暖めておく）を両方とも５分に短縮すると１桁ぐらい効率が落ちる．最初の氷冷１５分，オーバーグロース５分では半分ぐらいの効率である．ライゲーションミックスのデキがよく必要なクローンがわずかなら，問題ない程度の効率低下であろう．この間にＸｇａｌをプレートに塗ったりしていれば時間配分をかなり合理化できる．
REFERENCE
Inoue H, Nojima H, Okayama H.1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96:23-28.
野島 博. 1991.大腸菌へのDNA導入（トランスフォーメーション）1. 高効率コンピタントセル調整法, pp46-51, 村松正実・岡山博人（編）, 遺伝子工学ハンドブック, 羊土社, 東京.
＜注＞
大腸菌株
ＤＨ５α，ＤＨ５αＦ'ＩＱ，ＸＬ１BlueＭＲＦ'など．いずれもグリセロールストックに他の菌がコンタミしないように厳密に管理しておけば，アガープレートにストリークしてシングルコロニーを分離する必要はないので１日節約できる．
ＤＨ５αはルーチンのトランスフォーメーションによい．lacIqを欠くのでプレートにＩＰＴＧを塗らなくてよい．菌の増殖は速くプラスミドの収量も多い．コロニーはスムーズでアガープレートからはがれやすいので，コロニーハイブリをするときにはメンブレンをよく濡らしておく．濡らし足りないとコロニーが全部メンブレンにくっついてしまう．
ＤＨ５αＦ'ＩＱは高効率で勝負用に使える．カラーセレクションにはＩＰＴＧが必要．菌の増殖は遅くプラスミドの収量もよくない．何度も植え継いでいるとＦプラスミドが脱落してただのＤＨ５になってしまう．１日目の小スケール培養時にカナマイシンを２μL加えるとＦプラスミドの脱落を防ぐことができる．
ＸＬ１BlueＭＲＦ'はメチル化ＤＮＡの制限機構を欠くので，ゲノムＤＮＡのクローニングに適している．カラーセレクションにはＩＰＴＧが必要．何度も植え継いでいるとＦプラスミドが脱落する．１日目の小スケール培養時にテトラサイクリンを２μL加えるとＦプラスミドの脱落を防ぐことができる．コロニーは柔らかくほぐれやすいので，コロニーハイブリをするときにメンブレンを濡らしすぎると，メンブレンをはがすときに水気で菌体が流れて隣のコロニーとコンタミしやすい．
グリセロールストック
オートクレーブした８０％グリセリンをエッペンドルフチューブに５００μL分注し，菌の培養液を約３００μL加えてゆっくり完全に撹拌．−８０℃で凍結保存．凍結前にチビタンでフラッシュすると用時の取り扱いが楽．数回の凍結融解は問題ない．また，10年ぐらい前のものでも大丈夫．ただし，あまりに古くなると増殖が悪くなることがある．その際にはストックをＬＢプレート（抗生物質不含有またはＦプラスミド選択用抗生物質含有）にまいて，増殖力の強いコロニーを拾いなおす．
オーバーグロース
大きなインキュベータの中にローテータを入れて回す．インキュベータが小さすぎるとローテータの発熱で高温になりすぎることがある．大型のインキュベータもローテータもない貧乏ラボでも，５０ｍｌファルコンチューブの中にティッシュと一緒に２ｍｌチューブを入れ，３７℃にしたウォーターバスシェイカーで振るとよい．ファルコンチューブとティッシュはあらかじめ３７℃で暖めておき，振るときには横倒しにして完全に水没させる．
コンピテントセルの
効率計算
１０pg／μLのプラスミド溶液１μLを１００μLのコンピテントセルにトランスフォーメーションし，１０倍のＳＯＣでオーバーグロースのあと，その１００μLを塗ったプレートから１００個のコロニーが現れたら，
１０5+2+1＝１０8cfu／μgプラスミド・１００μLコンピテントセル．（１０pg＝１０-5μg，１００＝１０2）
用意する試薬類
ＳＯＢ培地
２００ｍｌ用（以下の培地とＭｇ液を無菌的に100:1に混合する）
培地
バクトトリプトン ４ｇ
イーストエキス １ｇ
５Ｍ ＮａＣｌ ０.４ｍｌ
３Ｍ ＫＣｌ ０.１６７ｍｌ
水 ２００ｍｌ
オートクレーブ
Ｍｇ液
ＭｇＳＯ4・7Ｈ2Ｏ ２.４６５ｇ
ＭｇＣｌ2・6Ｈ2Ｏ ２.０３３ｇ
ミリＱを加えて１０ｍｌに
オートクレーブ
抗生物質を含まないので，厳密に無菌的に調製すること．冷蔵で１年程度はＯＫ．
ＳＯＣ培地
ＳＯＢ培地と以下のグルコース液を無菌的に100:1に混合する
グルコース ３.６０３ｇ
ミリＱを加えて１０ｍｌに
オートクレーブ
抗生物質を含まないので，厳密に無菌的に調製すること．冷蔵で１年程度はＯＫ．
ＴＢ
２００ｍｌ用
ＰＩＰＥＳ ６ｇ
ＣａＣｌ2・2Ｈ2Ｏ ０.４４ｇ （無水の
場合は０.２９７ｇ）
３Ｍ ＫＣｌ １６.６３ml
ミリＱを加えて約１９０ｍｌに
ＫＯＨでｐＨ６.７に調整したあと
ＭｎＣｌ2・4Ｈ2Ｏ ２.１８ｇ加える
ミリＱを加えて２００ｍｌに
０.２μmのボトルトップフィルターを使って濾過滅菌
抗生物質を含まない培地とともに用いるので，厳密に無菌的に調製すること．冷蔵で１年以上ＯＫ．
ＬＢ，Ａｍｐアガープ
レート
２０〜３０枚用
バクトトリプトン ３ｇ
イーストエキス １.５ｇ
５Ｍ
ＮａＣｌ ５.１３４ｍｌ
アガー ４.５ｇ
水 ３００ｍｌ
オートクレーブ（やかんでオートクレーブすると便利）
ここからの操作はクリーンベンチ内で行う．
容器を手のひらで１秒ぐらい触れるようになるまでさめたら，Ａｍｐを３００μL加えて撹拌．
滅菌ディスポプレート（径約９ｃｍ）に１０〜１５ｍｌ注ぎ，ぐるりと傾けて全体に行き渡らせる．
次々とプレートに注いでいくが，もたもたしていると固まってしまうので，ガスバーナーでやかんをちょいちょいとあぶりながら注いでいく．
アガーが固まったら，ふたをずらして３０〜６０分クリーンベンチ内で風を当てて乾かす．
ふたの曇りがなくなったら，ふたをして１０枚づつラップで包み，ひっくり返して冷蔵保存．
１〜２カ月ぐらいはＯＫ．それ以上古くなったら用時にＸｇａｌ，ＩＰＴＧといっしょにプレートあたりＡｍｐを３〜５μL塗るとよい．
３Ｍ
ＫＣｌ（１００ｍｌ用）
ＫＣｌ ２２.３６５ｇ
ミリＱを加えて１００ｍｌに
オートクレーブ後冷蔵保存（１年以上ＯＫ）
Ａｍｐ
アンピシリンナトリウム５００ｍｇを１０ｍｌの５０％エタノールに溶解．凍結保存（凍らないが）．１年以上ＯＫ．エタノールベースなのでぞんざいに扱ってもコンタミの心配はない．
カナマイシン，テトラサイクリン
カナマイシンまたはテトラサイクリン５００ｍｇを１０ｍｌのミリＱに溶解．クリーンベンチ内で０.２μmのシリンジフィルターで濾過滅菌し，凍結保存．
凍結融解を繰り返すと力価が落ちる可能性があるので，少量づつ分注して保存．
Ｘｇａｌ
Ｘｇａｌ１００ｍｇをジメチルホルムアミド５ｍｌに溶解．適当に分注して凍結保存（凍らないが）．１年以上ＯＫ．
ＩＰＴＧ
ＩＰＴＧ１１９ｍｇをミリＱ５ｍｌに溶解．適当に分注して凍結保存．１年以上ＯＫ．
